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    Biacore案例集锦:外泌体互作检测深度解析

    外泌体是一类细胞爆发的细胞外囊泡 (EVs)  ,直径约40~160 nm ,它们携带核酸、卵白质、脂质和代谢物 ,是细胞间的通讯介质 ,影响细胞生物学的各个方面 。人体险些所有类型的细胞在正常及病理状态下均可排泄外泌体 ,外泌体广泛漫衍在如血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等 。



    由于外泌体等EVs具有高生物利用度、生物稳定性、靶向特异性、低毒性和低免疫原性 ,其在疾病诊断、治疗及药物递送中潜力 。Biacore作为分子互作“金标准” ,研究EVs虽然也离不开ta 。


    工程化外泌体逆转肿瘤免疫治疗中的T细胞衰竭


    免疫检查点疗法通过调理T细胞中的免疫检查点信号通路来增强抗癌免疫应答 ,取得了重要的临床进展 ,然而由于免疫衰竭 ,凌驾一半的癌症患者对这种治疗没有反应 。北京大学吕万良教授团队针对肿瘤免疫检查点治疗中免疫衰竭与免疫逃逸的问题 ,重组构建了一种基因工程外泌体PD1 - Imi Exo ,用于逆转肿瘤免疫治疗中的T细胞衰竭 。相关研究于今年初在线宣布在Bioactive Materials杂志[2] 。


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    图1:工程化外泌体PD1 - Imi Exo研究路线及作用机制


    PD1- Imi Exo通过基因工程设计PD1 ,同时包裹一种免疫佐剂Imiquimod ,可以首先阻断CD8+ T细胞与肿瘤细胞的结合 ,体现出PD1/PDL1免疫检查点阻断作用 ,并通过释放Imiquimod增进未成熟树突状细胞成熟 ,激活和恢复CD8+ T细胞的功效 ,逆转免疫衰竭(图1) 。

    为了验证PD1 Exo与PDL1的直接结合 ,作者使用Biacore划分测定了PDL1与PD1卵白及与PD1 Exo的结合(图2) 。作者首先将PDL1卵白偶联在CM5芯片上 ,PD1卵白或PD1 Exo作为剖析物 ,测定结合变革 。结果标明 ,相较于PD1卵白 ,PD1 Exo与PDL1的亲和力提高了数百倍 。而除了亲和力信息外 ,Biacore实时检测的特点可以获得二者的结合速率息争离速率信息 ,相较于PD1卵白 ,PD1 Exo与PDL1的解离明显变慢 ,说明其与PDL1的结合越发稳定 ,预示着其可能具有较长的药效 。


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    图2:Biacore检测PDL1与PD1卵白 (G) 与PD1 Exo (H) 的结合


    文中实验还标明 ,PD1 - Imi Exo呈水泡状圆形(约139 nm) ,对肿瘤细胞和树突状细胞均有明显的靶向作用和较强的结相助用 ,对玄色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠均有显著的治疗效果 。本研究也为提高PD1/PDL1的治疗效果 ,通过重建患者的免疫功效来预防术后肿瘤复发或转移 ,从而牢固整体预后提供了一种有希望的新战略 。


    抗体组装EV要领研究


    除了通过基因工程化革新外 ,胞外对已疏散的细胞外囊泡 (EV) 外貌进行工程化革新的要领不受细胞活性影响 ,还可以引入非天然的分子 。意大利布雷西亚大学的研究团队2023年在Nanoscale Advances宣布的封面文章中 ,划分利用物理吸附与化学吸附(利用点击化学共价结合)两种要领将Cetuximab (CTX) 修饰在Red blood cell EV外貌 ,并使用Biacore检测两种要领制备的REV与靶点EGFR结合的差别[3] 。


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    图3:抗体EV组装要领示意图


    作者使用Biacore X100 ,将EGFR偶联在CM5芯片上 ,划分检测了EGFR与EGF、CTX、mCTX (modfied CTX) 、天然REVs、四种工程化REVs的亲和力 。EGF、CTX与EGFR的亲和力均与文献报道相符 (67.3nM、1.8nM)  ,而化学修饰则使CTX的亲和力降低 ,mCTX亲和力为3.6nM 。在检测EGFR与外泌体的结适时 ,首先天然的REVs未视察到结合信号 ,化学吸附的REVs-click-mCTX的亲和力为0.17nM ,高于mCTX十倍 ,且泛起典范的慢解离历程 ,物理吸附的外泌体REVs-physi-mCTX亲和力与REVs-click-mCTX相当 。


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    图4:Biacore X100检测EGFR与卵白或REVs的亲和力


    别的 ,作者还发明 ,同一张EGFR芯片检测中 ,REVs-click-mCTX的饱和结合信号Rmax比REVs-physi-mCTX高4倍 ,推测可能时由于物理吸附较弱 ,当mCTX与芯片外貌的EGFR结合更强时 ,mCTX从REVs上脱落下来 ,牢牢地结合在芯片外貌地EGFR上 ,并与REVs-physi-mCTX竞争性结合EGFR ,最终导致芯片外貌的最大结合量Rmax降低 。而工程化的REVs-mCTX稳定性可能对体外囊泡摄取及其实际治疗应用具有重要意义 ,细胞实验发明REVs-click-mCTX对靶细胞体现出更好的结合和摄取能力 。


    液体活检要领开发


    外泌体广泛漫衍在血液与体液等液态标本中 ,通过检测其内容物或外貌生物标记物等 ,可以进行精准的疾病诊断 。锡耶纳大学研究团队发明玄色素瘤细胞在常氧和缺氧条件下都释放小细胞外囊泡sEV ,但只有缺氧诱导的sEV表达CA-IX mRNA和CA-IX卵白 ,据此开发一种ELISA检测要领 ,相关结果于2023年宣布在International Journal Of Molecular Sciences[4] 。

    缺氧处理HEK293pRTS-CA9 cells获得sEVs后 ,为了鉴定其外貌是否有CA-IX卵白 ,作者使用Biacore划分检测了anti-CA-IX 抗体与CA-IX卵白及sEVs的结合 ,确定了sEVs外貌的CA-IX卵白 。


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    图5:Biacore检测anti-CA-IX抗体与CA-IX卵白及sEVs的结合


    外泌体等细胞外囊泡的功效研究 ,及其在在治疗、诊断领域的开发愈加火热 ,连续的技术和实验进展将会揭示更多其异质性和生物学功效的信息 ,增进其用于治疗和诊断疾病 。Biacore作为高灵敏、高精准分子互作技术 ,可以为种种型分子间的相互作用提供高质量结合动力学、亲和力、浓度等数据 ,期待与宽大用户配合发明更多新疗法 ,新应用 。


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