近日
北京市自然科学基金
资助的重点研究专题项目
“超高区分冷冻电子显微镜
成像要领研究与应用”
在该项目支持下，北京大学毛有东教授团队于2022年4月27日在国际学术期刊Nature杂志在线宣布了题为“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的研究论文，剖析了原子水平人源卵白酶体动力学调控和构象重编程机制，并在国际上展示了人工智能四维重建技术用于大幅提升时间区分冷冻电镜剖析精度 。
卵白酶体功效紊乱与人体多种疾病相关，如癌症、神经退行性疾病和免疫疾病等 。卵白酶体是美国FDA批准的多种治疗癌症的上市小分子药物的直接靶标 。
在正常细胞中，卵白酶体的功效受到多个水平的严格调控 。去泛素化酶USP14是主要的卵白酶体调控分子，被认为是一个潜力大的治疗癌症和神经退行性疾病的重要靶标，其小分子抑制剂曾进入过美国一期临床研究，但围绕USP14功效机制的一系列悬而未决的要害问题限制了其靶向药物分子的开发和临床应用 。USP14通过结合26S而被激活，然后以毫秒的时间标准剪切底物上的泛素链 。它是如何被卵白酶体激活并调控卵白酶体功效的，一直是研究机构和生物制药领域期待解决的要害科学问题 。生命分子机械通过庞大的非平衡动力学历程和结构变革来实现其特殊功效，这一历程进而受到种种庞大分子间相互作用的精准调控 。如何在原子水平直接视察天然态超大分子机械的功效态动力学历程，给现有的原子结构动态剖析技术提出了挑战 。毛有东教授实验室恒久致力于生长基于冷冻电镜的动力学重建要领，围绕卵白酶体、炎症小体等具有重大临床应用前景的靶点系统的结构功效、动力学机制和靶向调控分子设计深入开展交叉研究 。课题组前期的系列事情揭示了卵白酶体的原子架构、组装原理和降解泛素化底物的动力学基本纪律 。
本研究课题进行之初，首先要克服的问题就是“时间区分” 。卵白酶体降解底物的历程是很快的，时间标准在毫秒至秒之间 。正常条件下，想要通过冷冻电镜技术捕获此历程的中间态结构，是很是困难的 。所以，课题组首先要让这个历程慢下来 。通过大宗的条件摸索，重建反应动力学体系和优化反应条件，包括优化缓冲体系、反应温度等条件，课题组优化出较为可行的实验计划，从而使得时间区分冷冻电镜技术应用成为可能，获得了含时的45,193张USP14-26S复合体降解泛素底物历程中的冷冻电镜透射图样，挑取了3,556,806个USP14-26S-泛素底物复合体的颗粒图像 。
接下来面临的极端挑战就是“三维分类”，冷冻电镜捕获的复合体图像需要经过一系列的分类，将它们归为差别的构象类别，才华泛起出卵白反应的动态历程 。USP14结合到26S卵白酶体后，使得降解底物的动力学历程越发庞大，想要在如此多的异构复合体颗粒图像中，鉴别出降解历程的各个时态的高区分率非平衡构象，古板的三维分类要领是无法实现的 。低精度的三维分类将导致低辩白的三维重建，从而无法获取原子水平的动力学信息，无法对含时的数据付与自洽的动态变革的物理意义 。课题组结合经过数年自主开发的新型深度学习高精度三维分类和四维重建要领，捕获了USP14-26S复合体降解多泛素化底物历程的13种差别功效中间状态的高区分率（3.0~3.6埃）非平衡构象，通过时间区分冷冻电镜剖析，重建了受控卵白酶体的完整动力学事情周期，并结合分子生物学功效和基因突变研究，剖析了USP14和26S相互调控活性的原子结构基础和非平衡动力学机制 。研究发明USP14的活化同时依赖于泛素识别和卵白酶体RPT1亚基的结合 。出人意料的是，USP14通过别构效应，诱导卵白酶体同时沿着两条并行状态转变路径爆发构象变革；课题组乐成捕获到了底物降解中间状态向底物抑制中间状态的瞬时转化 。在底物降解途径中，USP14活化变构地重编程AAA-ATP酶马达的构象景观（Conformational landscape）和统计漫衍，并刺激20S底物通道的翻开，从而视察究竟物连续转运历程的ATPase六聚马达非对称ATP水解和近乎完整的全周循环周期 。USP14-ATPase的动态相互作用，使得ATPase马达底物识别与26S自身的去泛素化酶RPN11催化爆发去耦合效应，并在26S的泛素识别、底物的起始易位和泛素链接纳历程中引入三个调控检查点（动力学分岔点） 。这些发明为USP14调理26S的完整功效周期提供了新的高区分见解，并为USP14靶向药物治疗发明涤讪了极为重要的机制基础 。
图2. 通过时间区分冷冻电镜剖析获取的USP14调控卵白酶体底物降解的并行路径模型 。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
这是将人工智能四维重建技术用于提升时间区分冷冻电镜剖析精度，针对重大疾病靶卵白复合体，实现原子水平功效动力学视察的国际原创结果，展示了一类新型的卵白质复合动力学研究范式 。Nature同期在线宣布了专栏推介文章，评价该结果是一项重大研究，解决了原子水平USP14（泛素特异性肽酶14）活化和其调控卵白酶体功效的机制问题 。
相关论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8
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